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Laboratorio di Fisiologia Molecolare
e Neurobiologia
Dipartimento di Bioscienze
Università di Milano
Via Celoria 26, 20133
Tel. 02.503.14931
Fax 02.503.14932

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La corrente funny

L´attività ritmica cardiaca è generata dalle cellule pacemaker, che nei mammiferi sono localizzate nel nodo senoatriale. Il potenziale d´azione delle cellule del nodo senoatriale presenta una particolare fase chiamata depolarizzazione diastolica (o pacemaker), che alla fine di un potenziale d´azione guida il potenziale di membrana fino alla soglia per la generazione di un nuovo potenziale d´azione, e quindi determina l´attività ritmica cardiaca. Qual è il meccanismo che controlla la depolarizzazione pacemaker?

rate modulationNel 1979, Brown, DiFrancesco e Noble, hanno descritto, nelle cellule pacemaker cardiache, la corrente "funny" (If), chiamata così a causa delle sue proprietà inusuali. Dal momento che questa corrente è entrante, e si attiva lentamente in iperpolarizzazione a voltaggi compresi nel range diastolico, gli autori hanno ipotizzato che potesse essere coinvolta nella generazione dell´attività spontanea; la corrente è inoltre aumentata dall´adrenalina, suggerendo un suo coinvolgimento nel meccanismo di accelerazione dell´attività pacemaker, e quindi del ritmo cardiaco, indotto dalle catecolamine. Questa corrente è stata descritta precedentemente anche in un´altra preparazione cardiaca che presenta attività spontanea, le fibre di Purkinje, ma è stata definita come pure corrente di potassio, uscente a voltaggi diastolici (corrente IK2, Noble & Tsien, 1968). La corrente IK2 delle fibre del Purkinje è simile alla If nodale, per molti aspetti, e l´apparente natura ionica differente rimane un argomento dibattuto fino al 1981, quando venne proposta una reintepretazione della corrente IK2 (DiFrancesco 1981 a,b), dimostrando che le due correnti erano infatti identiche, e che la corrente IK2 è stata erroneamente interpretata per più di 10 anni come una pura corrente di potassio. Ciò ha dimostrato l´identità delle componenti pacemaker nelle diverse cellule cardiache. In seguito a questa prima descrizione, l´If è stata ampiamente caratterizzata nelle cellule cardiache (DiFrancesco, 1993). L´If è una corrente mista di Na+ e K+, che si attiva in iperpolarizzazione da una soglia di circa -40/-50mV. Alla fine di un potenziale d´azione, quando la membrana ripolarizza al di sotto di questa soglia, l´If viene attivata e fornisce corrente entrante, che è responsabile della generazione della fase di depolarizzazione diastolica. La corrente If è inoltre modulata dal cAMP intracellulare, mediante un´azione diretta sui canali-f e non mediata da fosforilazioni (DiFrancesco & Tortora, 1991). L´aumento di cAMP, sposta la curva di attivazione della If verso potenziali più positivi e quindi fornisce una maggior corrente entrante per la depolarizzazione pacemaker. Quest´azione è alla base della modulazione del ritmo cardiaco da parte del sistema nervoso autonomo. Nelle cellule cardiache, la sintesi di cAMP è stimolata e inibita dai ß-agonisti e da agonisti muscarinici, rispettivamente; quindi, la stimolazione simpatica accelera e quella vagale rallenta il ritmo cardiaco, rispettivamente aumentando e diminuendo la corrente If ai potenziali diastolici mediante variazioni dei livelli di cAMP. Un´attività vagale moderata, come quella associata al tono vagale basale, controlla il ritmo cardiaco modulando la If e non, come si pensava precedentemente, attraverso l´apertura dei canali di potassio attivati dall´acetilcolina (DiFrancesco, Ducouret & Robinson, 1989). La corrente If ha una conduttanza di singolo canale abbastanza bassa (circa 1pS, DiFrancesco, 1986). Il legame delle molecole di cAMP ai canali f induce un cambio conformazionale della proteina, associato ad un aumento della probabilità di apertura del canale in iperpolarizzazione (DiFrancesco & Mangoni, 1994). Questo meccanismo può essere interpretato in termini di attivazione allosterica del canale indotta da cAMP, secondo cui il cAMP si lega preferenzialmente, e quindi stabilizza, la configurazione "aperta" del canale (DiFrancesco, 1999). Correnti simili a If sono state descritte in varie preparazioni neuronali (corrente Ih, Pape, 1996). Generalmente, il ruolo della corrente Ih nei neuroni è basato sulla sua abilità di generare una depolarizzazione, in seguito sia a iperpolarizzazione della membrana, sia a modificazione dei livelli di cAMP intracellulari mediata da attivazione recettoriale. Quindi, la Ih può contribuire al controllo del potenziale di riposo, e alla modulazione dell´eccitabilità e alla frequenza di scarica. Nei neuroni sensoriali, la corrente Ih è coinvolta nella percezione degli stimoli esterni o nella modulazione della trasduzione degli stimoli sensoriali in segnali elettrici. La corrente Ih è anche espressa in alcune terminazioni pre-sinaptiche, dove è coinvolta in fenomeni di plasticità (Beaumont & Zucker, 2000; Mellor et al. 2002). L´importanza dei canali-f nella generazione e controllo del ritmo cardiaco, ipotizza un loro possibile uso come target farmacologico. Sono state sviluppate numerose molecole che rallentano il ritmo cardiaco, capaci di indurre bradicardia senza effetti collaterali inotropici, come UL-FS, ZD 7288 e l´ivabradina. Le sostanze in grado di rallentare il ritmo in modo specifico, hanno un potenziale uso terapeutico in tutti quei casi in cui è utile rallentare il ritmo cardiaco senza alterare le altre funzioni vascolari. Sono stati ottenuti sostanziali progressi nella conoscenza delle proprietà molecolari dei canali pacemaker con il clonaggio, alla fine degli anni ´90, della famiglia dei canali HCN (Hyperpolarization-activated, Cyclic-Nucleotide-gated). I canali HCN sono caratterizzati da una struttura simile a quella dei canali di potassio voltaggio-dipendenti (Kv) e ai canali modulati dai nucleotidi ciclici (CNG). Le proprietà dei canali HCN espressi in sistemi eterologhi mostrano che questi canali sono i determinanti molecolari dei canli pacemaker nativi nel cuore e nel sistema nervoso.

Pacemaker Biologico

Le aritmie cardiache sono patologie comuni che comprendono disordini complessi e multifattoriali del ritmo cardiaco. I casi di forte bradicardia (i.e., la diminuzione del ritmo cardiaco) e il blocco del nodo atrio-ventricolare spesso richiedono l´impianto di un pacemaker elettronico come unica terapia possibile. Lo scopo di questo progetto è quello di creare un substrato cellulare in grado di generare autonomamente attività spontanea ripetitiva e agire perciò da "pacemaker biologico"; la sfida ultima di questo progetto sarà l´impianto di un pacemaker biologico al posto dei dispositivi elettronici ad oggi utilizzati.
embryonic stem cellsL´approccio è basato sul differenziamento in vitro di cellule staminali (embrionali o adulte) verso un fenotipo cardiaco, pacemaker-like, durante il quale le cellule sono guidate ad acquisire una serie di canali ionici e altre proteine necessarie a generare potenziali d´azione spontanei. La conferma funzionale di questa strategia comprende: a) caratterizzazione delle proprietà elettriche dei cardiomiociti derivati dalle cellule staminali (voltage- and current-clamp); b) l´analisi dei canali ionici e di altre proteine senoatriali tramite RT-PCR, Western Blot e analisi confocale; c) valutazione dell´abilità di queste cellule di modificare e di guidare l´attività spontanea di una coltura primaria di cellule ventricolari.

Genetica delle patologie dei canali pacemaker

HCN diseasesLe patologie cardiache associate a disordini del ritmo hanno la maggior incidenza e rappresentano una delle maggiori cause di mortalità nei paesi occidentali. Negli ultimi anni, gli approcci molecolari apllicati alla ricerca cardiovascolare, hanno permesso di identificare molti difetti genetici che portano ad alterazioni della funzionalità cardiaca. Un lavoro recente del nostro gruppo ha identificato una mutazione nel gene hHCN4 (S672R), una isoforma umana del canale pacemaker, che è responsabile di una forma familiare di bradicardia (Milanesi et al. 2006). La ricerca è stata ora estesa a potenziali nuove mutazioni del gene hHCN4 in pazienti che presentano forme familiari di patologie cardiache sintomatiche ed ereditarie, che affliggono l'attività pacemaker senoatriale. Il DNA genomico viene estratto dai pazienti e da individui sani e il gene hHCN4 viene amplificato per PCR. I frammenti di DNA vengono analizzati con SSCP, una tecnica che permette di identificare una mutazione a livello del singolo nucleotide, e/o polimorfismi in una sequenza. Una volta che l´analisi genetica è completata (origine familiare, analisi di linkage e così via), la mutazione di interesse viene espressa in vitro in un sistema eterologo (cellule HEK293), per permettere l´analisi funzionale attraverso esperimenti di patch-clamp e immunofluorescenza.

Farmacologia dei canali pacemaker

HCN pharmacology

Le sostanze in grado di bloccare selettivamente il canale f hanno un potenziale uso terapeutico in tutti quei casi in cui è utile rallentare il ritmo cardiaco senza alterare altre funzioni cardiovascolari come la contrattilità ventricolare. Negli anni passati, sono state sviluppate diverse molecole in grado di bloccare i canali pacemaker, come la zetabradina, lo ZD7288 e l´ivabradina, ma solo l´ivabradina ha superato tutti i trials clinici ed è attualmente commercializzata come farmaco antiangina in diversi stati, con il nome commerciale di Procoralan. Il suo effetto benefico consiste in un rallentamento selettivo del ritmo cardiaco, senza significative azioni avverse come una riduzione dell´inotropismo, effetto collaterale tipico di inibitori del ritmo meno specifici, come i beta-bloccanti o i calcio-antagonisti. L´azione inibitoria sul ritmo cardiaco dell´ivabradina è dovuta a un blocco selettivo dei canali f. Il nostro gruppo ha dimostrato che l´ivabradina blocca la If senoatriale in modo uso- e corrente-dipendente (Bucchi et al., 2002). La caratterizzazione dell´effetto bloccante dell´ivabradina è stata inoltre estesa alle isoforme HCN1 e HCN4 (Bucchi et al. 2006). Ciò ha rivelato differenze inaspettate nel meccanismo di blocco delle due isoforme: mentre l´ivabradina si comporta come un bloccante a "canale aperto" per i canali f nativi e HCN4, per i canali HCN1 si comporta come bloccante "a canale chiuso". Le differenze nel modo di azione di questa molecola possono essere sfruttate per sviluppare nuove molecole con una più alta specificità per le diverse isoforme.

Localizzazione in membrana dei canali HCN

HCN localization

Questa linea di ricerca ha lo scopo di investigare la localizzazione subcellulare dei canali HCN, la loro interazione con i microambienti cellulari e i meccanismi attraverso i quali queste interazioni modificano le proprietà funzionali dei canali. Un precedente studio del nostro gruppo ha dimostrato che i canali f nativi localizzano in microdomini di membrana (lipid raft/caveolae) e che questa localizzazione è importante per una corretta funzione (Barbuti et al. 2004). Usando un approccio combinato basato su protocolli biochimici (immunocitochimica, co-immunoprecipitazione e western blot) e sulla tecnica del patch-clamp, stiamo valutando la rilevanza della localizzazione caveolare dell´HCN4 in relazione alla modulazione del canale da parte dell´attivazione di specifici ß1 o ß2 recettori adrenergici (Barbuti et al. 2006). Inoltre, dal momento che i canali HCN possiedono un dominio di interazione per la caveolina, stiamo investigando gli effetti di mutazioni nella sequenza consensus sulle proprietà del canale e sulla sua localizzazione. I risultati di questa ricerca potranno aiutare a chiarire i meccanismi che regolano la funzione dei canali HCN nella cellula.


   
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